Zusammen mit Johannes Kepler bewirkte er auf dem Gebiet der Wissenschaften einen Umbruch, indem er das heliozentrische Weltsystem von Nikolaus Kopernikus weiterentwickelte, das später durch den englischen Physiker Sir Isaac Newton bewiesen wurde.
In der Astronomie machte Galileo Galilei bedeutende Entdeckungen:
Er verwendete das neu erfundene Fernrohr zur astronomischen Beobachtung und erforschte damit die Sonnenflecken, Gebirge und Mare auf dem Mond, die vier größten Jupitermonde sowie die Venusphasen.
In der Physik entdeckte er die Fallgesetze und die Bewegungsgesetze von Geschossen.
Galileis historische Leistung besteht auch in seinem Einsatz für wissenschaftliches und unabhängiges Denken sowie in seinem Kampf gegen Autorität und Dogma. Seine wissenschaftliche Methodenlehre sowie sein Ansatz einer Mathematisierung der Naturwissenschaften übten einen großen Einfluss auf die neuzeitlichen Naturwissenschaften aus.
Galilei wurde am 15. Februar 1564 in Pisa geboren. Sein Vater, Vincenzo Galilei, war Komponist und Musiktheoretiker und spielte in der Musikgeschichte eine wichtige Rolle beim Übergang von der erstarrten mittelalterlichen Musik zu neuen, freieren Kompositionstechniken. Zu der Zeit, als Vincenzo Galilei erkannte, dass starre Theorien in der Musik neue Formen unterdrückten, gelangte auch Galileo Galilei zu der Einsicht, daß die aristotelische physikalische Theorie neue wissenschaftliche Untersuchungen behinderte.
Galilei wurde von Mönchen in Vallombroso unterrichtet;
1581 schrieb er sich an der Universität von Pisa ein, um Medizin zu studieren, bald darauf wandte er sich der Philosophie und Mathematik zu und erhielt
1589 einen Lehrstuhl für Mathematik in Pisa. Es wird berichtet, daß er seinen Studenten die irrtümliche aristotelische Lehrmeinung - nach der die Fallgeschwindigkeit dem Gewicht eines Körpers proportional sei - anschaulich widerlegte, indem er zwei unterschiedlich schwere Gegenstände gleichzeitig vom Schiefen Turm herunterfallen ließ. Galileis Vertrag wurde
1592 nicht verlängert - möglicherweise weil er im Widerspruch zu Gelehrten stand, welche die aristotelische Lehrmeinung vertraten.
Im gleichen Jahr wurde ihm der Lehrstuhl für Mathematik an der Universität Padua übertragen, den er bis 1610 innehatte. In Padua erfand Galilei einen Proportionalzirkel zur praktischen Lösung mathematischer Probleme. Er wandte sich immer mehr von der spekulativen Physik ab und führte sorgfältige Messungen durch, entdeckte die Gesetze fallender Körper und der parabolischen Bahn von Geschossen, untersuchte die Pendelbewegungen und forschte auf dem Gebiet der Mechanik.
Für Astronomie zeigte Galilei zunächst eher wenig Interesse, obgleich er ab 1595 der kopernikanischen Theorie, nach der sich die Erde um die Sonne dreht, gegenüber dem ptolemäischen Weltbild den Vorrang gab. Dieses ging davon aus, daß die Sonne und die Planeten um die im Mittelpunkt stehende Erde kreisten. Nur durch das kopernikanische Modell war Galileis Gezeiten-Theorie verständlich, die auf den Bewegungen der Erde beruhte.
1609 baute Galilei ein Fernrohr nach, das ein Jahr zuvor in den Niederlanden erfunden worden war, und führte es dem Dogen von Venedig vor. Da es für die Marine und die Seefahrt großen Nutzen brachte, wurde Galileis Gehalt verdoppelt und ihm eine lebenslange Anstellung als Professor zugesichert. Im Dezember 1609 hatte Galilei ein Teleskop mit zwanzigfacher Vergrößerung gebaut, mit dem er die Gebirge und Krater auf dem Mond erforschte. Er erkannte auch, daß die Milchstraße aus Sternen besteht, und entdeckte die vier größten Jupitermonde. Galilei veröffentlichte diese Erkenntnisse im März 1610 in Sidereus Nuncius (Sternenbotschaft). Aufgrund seines neuerworbenen Ruhmes wurde er in Florenz Hofmathematiker; er war dadurch von Lehrpflichten befreit und konnte sich ganz dem Forschen und Schreiben widmen.
Im Dezember 1610 hatte Galilei die Phasen der Venus beobachtet, die im Widerspruch zur ptolemäischen Astronomie standen und seine Bevorzugung des kopernikanischen Systems bestätigten. Galileis Entdeckungen standen im Widerspruch zur aristotelischen Auffassung, nach dem im All nur vollkommen kugelförmige Körper existierten. Auf dem Hintergrund seiner Auseinandersetzung mit den Professoren von Florenz und Pisa über Hydrostatik veröffentlichte er 1612 ein Buch über schwimmende Körper.
In den daraufhin verfaßten vier schriftlichen Angriffen auf dieses Buch wurden Galileis Auffassungen verworfen.
1613 veröffentlichte Galilei eine Arbeit über Sonnenflecken und sagte den Sieg der kopernikanischen Theorie voraus. Ein Pisaer Professor teilte den Medici (der herrschenden Familie in Florenz und Galileis Auftraggeber) in Galileis Abwesenheit mit, daß der Glaube an eine sich bewegende Erde ketzerisch sei. Galilei schrieb einen langen, offenen Brief über die Unanwendbarkeit biblischer Texte bei wissenschaftlichen Argumenten und hielt daran fest, dass sich die Auslegung der Bibel dem gestiegenen Wissensstand anpassen und dass kein wissenschaftlicher Standpunkt je zum Gegenstand des Glaubens gemacht werden sollte.
Zu Beginn des Jahres 1616 wurden kopernikanische Bücher durch Erlaß der Zensur unterworfen; der jesuitische Kardinal Robert Bellarmin wies Galilei an, dass er die Auffassung einer sich bewegenden Erde nicht mehr behaupten oder verteidigen dürfe. Kardinal Bellarmin hatte ihm zuvor geraten, dieses Thema nur hypothetisch und zu wissenschaftlichen Zwecken abzuhandeln, ohne die kopernikanischen Theorien wörtlich zu verstehen oder zu versuchen, sie mit der Bibel in Einklang zu bringen.
Galilei ließ jahrelang nichts über das Thema verlauten und arbeitete währenddessen an einer Methode, um die geographische Längen auf dem Meer mit Hilfe seiner Voraussagen über die Positionen der Jupitersatelliten zu bestimmen. Außerdem nahm er seine früheren Studien zu fallenden Körpern wieder auf und legte seine Ansichten über wissenschaftliches Denken in einem Buch über Kometen, Saggiatore (1623, Prüfer mit der Goldwaage), dar.
Ab 1624 arbeitete Galilei an einem Buch, in dem er die ptolemäische und die kopernikanische Hypothese in bezug auf die Physik der Gezeiten diskutierte und das er "Dialog über die Gezeiten" nennen wollte. Die katholischen Zensoren in Rom ließen 1630 das Buch zum Druck zu, nur der Titel mußte in "Dialogo sopra i due massimi sistemi" (1661, "Dialog über die zwei hauptsächlichsten Weltsysteme") geändert werden. Es wurde 1632 in Florenz veröffentlicht.
Trotz zweier behördlicher Genehmigungen wurde Galilei von der Inquisition nach Rom geladen, um sich vor Gericht dem Verdacht der Ketzerei zu stellen. Diese Anschuldigung beruhte auf einem Bericht, in dem Galilei 1616 persönlich befohlen worden war, die kopernikanische Theorie weder mündlich noch schriftlich zu diskutieren. Kardinal Bellarmine war gestorben, doch Galilei legte ein vom Kardinal unterzeichnetes Zertifikat vor, nach dem Galilei keiner anderen Beschränkung als derjenigen unterliegen sollte, die seit 1616 für jeden römischen Katholiken galt. Es wurde nie ein unterzeichnetes Dokument gefunden, das dem widersprach. Trotzdem wurde Galilei 1633 gezwungen, abzuschwören sowie zu lebenslanger Haft verurteilt, die dann zu ständigem Hausarrest gemildert wurde. Es wurde angeordnet, den Dialog zu verbrennen; das Urteil gegen Galilei konnte in jeder Universität öffentlich eingesehen werden.

In seinem letzten Buch, "Discorsi e dimostrazioni matematiche" ("Unterredungen und mathematische Demonstrationen über zwei neue Wissenszweige, die Mechanik und die Fallgesetze betreffend", das 1638 in Leiden veröffentlicht wurde, überprüfte und verbesserte Galilei seine früheren Bewegungsstudien oder die Prinzipien der Mechanik. Das Buch eröffnete einen Weg, der zu Newton führte - zum universellen Gravitationsgesetz, das die Keplerschen Planetengesetze mit Galileis mathematischer Physik verband.
Galilei erblindete vor der Veröffentlichung des Buches und starb am 8. Januar 1642 in Arcetri bei Florenz.

Galileis größte wissenschaftliche Leistung bestand darin, daß er die Physik mit exakten Messungen anstatt mit metaphysischen Prinzipien und formaler Logik begründete. Von größerem Einfluss waren die "Sternenbotschaft" und der "Dialog", die neue Perspektiven in der Astronomie eröffneten. Galileis lebenslanger Kampf, um die wissenschaftliche Untersuchung von der Beschränkung durch philosophische und theologische Behinderung zu befreien, gewann nicht nur wissenschaftliche, sondern darüber hinaus auch historische Bedeutung.
Nach der vollständigen Veröffentlichung der Gerichtsdokumente vom Prozess gegen Galilei in den siebziger Jahren des 19. Jahrhunderts wurde die gesamte Verantwortung für Galileis Verurteilung der katholischen Kirche zugeschrieben. Dies verschleiert die Rolle der Philosophieprofessoren, die vor den Theologen Galileis Wissenschaft mit Ketzerei in Verbindung brachten. Eine Untersuchung zur Verurteilung des Astronomen, welche die Aufhebung des Urteils forderte, wurde 1979 von Papst Johannes Paul II. eröffnet. Im Oktober 1992 gestand eine päpstliche Kommission den Irrtum des Vatikans ein, und Galileo Galilei wurde offiziell rehabilitiert.